CRISPR基因编辑疗法，刷新多种疾病治疗新范式

星耀研究院 / 陶子

艾滋病病毒在感染人体后会将DNA序列整合到细胞基因组中，这也增加了其治愈的难度。目前，艾滋病的主要治疗方式是终生服用抗逆转录病毒药物，但其只能抑制病毒复制难以治愈。

2022年9月，Excision BioTherapeutics宣布其在研基因疗法EBT-101的1/2期临床首例患者已于2022年7月完成给药，初步结果表明EBT-101迄今为止耐受性良好。这是首次基于CRISPR对感染性疾病进行治疗，也是基因编辑疗法一个里程碑式的进展。

EBT-101作用原理

来源：Excision官网

据悉，EBT-101是一款体内CRISPR疗法，采用AAV装载CRISPR-Cas9和两种向导RNA（gRNA），能够同时靶向HIV基因组中的三个不同位点，进行多次切割，从而切除大部分HIV基因组，实现最大限度地减少潜在的病毒逃逸，有望提供一种治愈的治疗手段。其已经在临床前动物实验中展示出了功能性治愈艾滋病的潜力。

事实上，基因编辑应用于艾滋病最早在2020年就有报道，美国天普大学和内布拉斯加大学医学中心的研究人员曾在 Nature Communications 期刊上发表研究论文，成功地在非人灵长类动物的基因组中编辑并清除了与HIV密切相关的SIV-a病毒，这在艾滋病研究中迈出了重要一步。

而Excision公司相关临床研究的开发便是得益于天普大学此项研究的授权，据悉，除了基于CRISPR的艾滋病疗法之外，该公司的研发管线还包括使用CRISPR技术清除乙肝病毒（HBV）、单纯疱疹病毒（HSV）、乳头多瘤空泡病毒（JCV），以及新冠病毒（SARS-CoV-2）等。

此外，在2022年6月，以色列特拉维夫大学的研究人员在 Nature Biotechnology 期刊上发表了题为"In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice" 的研究论文，使用两种AAV同时递送 CRISPR-Cas9 基因编辑系统和靶向免疫球蛋白基因的修复模板，直接编辑小鼠内源 B 细胞的免疫球蛋白基因位点，有效地在体内修饰 B 细胞，使之能产生针对HIV 病毒的中和抗体。

这一研究不仅表明直接基因编辑B细胞从而产生特异性广泛中和抗体有望成为缺乏有效疫苗的传染性疾病的潜在治疗方案，同时，该研究团队还表示，预计在未来几年内，将能以这种方式生产治疗艾滋病、其他传染病和某些由病毒引起的癌症（如宫颈癌、头颈癌）的药物。

此前用于对抗新冠的手段主要是利用疫苗和口服特效药这两大武器，但因毒株的不断变异而越来越受限。基因编辑应用于新冠，在后疫情时代为冠状病毒疾病的预防和治疗提供了一种新的思路。而以上针对艾滋病等病毒传染性疾病的积极成果同时也为新冠病毒的研究奠定了坚实基础。

在去年7月，杜克大学医学院王前奔教授团队、俄亥俄州立大学感染疾病研究所刘善虑教授团队和药学院董一洲教授团队共同合作，在Nature Chemical Biology期刊上发表的一项研究首次证明了基因编辑技术可用于对抗新冠。

该研究团队基于新冠病毒进入人体的机制提出了一种新方法，利用CRISPR-Cas13d化学工程纳米系统，特异性靶向肺蛋白酶 Cathepsin L (CTSL) mRNA，以达到阻断SARS-CoV-2感染的新方法，通过该途径有望预防，甚至可能治疗新冠感染。

作者首先通过其最新开发的CRISPR–CasRx靶向系统暂时性的敲除CTSL mRNA，发现CasRx介导的特异性CTSL敲除在体外可有效抑制多种冠状病毒株的感染。为了研究CasRx介导的CTSL敲除是否可以在体内抑制SARS-CoV-2感染，研究者构建了一个可以将CasRx和pre-gCTSL递送到小鼠肺部的选择性LNP载体。结果显示，该选择性肺靶向LNP-CasRx-pre-gCTSL系统可以安全、有效、特异性降低肺CTSL的表达。

CasRx特异性CTSL敲除在体外有效抑制多种冠状病毒株感染

来源：参考资料1

相较于市面上的新冠疫苗而言，该途径不需要通过突刺蛋白识别出冠状病毒，它可特异性靶向所有冠状病毒进入人体所依赖的酶，因此它可对于所有的变异毒株都有效。另外，由于这一预防策略不依赖于身体的免疫系统，因此这个方法如果在人体中起作用，或可用于保护由于免疫系统受损而无法通过注射疫苗来抵御病毒的患者。但目前这项技术只在小鼠体内有效，并且其预防效果只能维持数天，该方法距离应用于人类治疗还有很长的路要走。

在癌症的治疗方面，CRISPR更多的是作为免疫细胞或干细胞工程化改造工具，以产生特定的或者“现货型”免疫疗法。

国内外进入临床阶段的基因编辑细胞疗法

目前临床上使用的基因编辑技术主要为第二代的TALENS和第三代的CRISPR/Cas9。其中CRISPR Therapeutics以及国内亘喜生物、邦耀生物、北恒生物等企业均是利用CRISPR/Cas9技术。在该领域进展较快的CRISPR疗法已进入临床2期，适应症主要还集中在血液肿瘤。

此外，不少企业也利用CRISPR/Cas9对干细胞进行编辑，开发工程化干细胞疗法，如基因编辑巨头CRISPR Therapeutics以及Vor Bio等。

其中，CRISPR与ViaCyte合作开发的VCTX210和VCTX211两款候选产品均为治疗1型糖尿病的基因编辑、同种异体、干细胞衍生的候选产品，通过移植干细胞分化而来的胰腺细胞，能够使得1型糖尿病患者恢复胰岛素分泌功能，达到功能性治愈的目的。该产品通过利用CRISPR/Cas9敲除了干细胞表面的T细胞攻击有关蛋白基因，使得移植细胞不会受到宿主免疫系统攻击。目前两款产品均已经进入临床。

而Vor Bio在研的trem-cel则是利用基因编辑技术改造的造血干细胞疗法，通过体外敲除编码CD33的基因，使回输到患者体内的造血干细胞将产生不表达CD33蛋白的健康新细胞，从而使这些健康细胞不会被CD33靶药物误伤，这一路径使靶向疗法的提高特异性的同时，降低其潜在的副作用。

2月21日，Vor Bio还公布了trem-cel治疗AML患者的1/2a期临床试验的初步结果。接受trem-cel治疗的首位患者在同时接受3个治疗周期的抗体偶联药物Mylotarg的治疗后，仍然维持造血功能。第二位接受trem-cel治疗的患者移植的造血干细胞也成功定植。这些数据继续显示trem-cel作为下一代造血干细胞移植疗法的潜力，它有望变革包括AML在内的血液癌症的治疗。

值得注意的是，在TCR-T方面，CRISPR技术也有应用。2022年3月，Intellia宣布其治疗AML的TCR-T细胞疗法NTLA-5001获得FDA的孤儿药认证。NTLA-5001就是一款基于CRISPR的TCR-T疗法，在去除T细胞的原有TCR的同时，引入靶向WT1的高亲和力TCR。目前，该候选药物的1/2a期临床试验正在进行中。

神经退行性疾病是机体神经元结构或功能逐渐丧失而引发的一类疾病，包括帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）、亨廷顿氏病（HD）、肌萎缩性侧索硬化（ALS）、脊髓性肌萎缩症（SMA）等。目前，应用于临床开发的基因编辑候选产品较少，但不少研究已经验证了其治疗该疾病的潜力。

今年2月16日，暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院李晓江教授，李世华教授，闫森研究员，联合中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员，在Nature Biomedical Engineering上发表了题为：Cas9-mediated replacement of expanded CAG repeats in a pig model of Huntington's disease的研究论文，利用AAV病毒载体表达CRISPR-Cas9基因编辑的技术修复及敲除亨廷顿猪模型的突变基因，首次在国际上证明基因治疗能有效的改善神经退行性疾病大动物模型的病理变化以及行为症状。

HD KI猪静脉注射CRISPR/Cas9可减轻运动功能缺陷

来源：参考资料2

利用基因敲入猪模型，该团队通过CRISPR-Cas9引起的同源臂重组将变异亨廷顿基因序列替换为正常人亨廷顿基因序列。同时还测试了脑部直接注射及周围静脉注射AAV病毒载体携带的CRISPR-Cas9对亨廷顿疾病模型猪的治疗作用，两种方法都可以把变异亨廷顿基因序列替换为正常基因序列, 并能有效治疗大动物模型的病理变化以及运动症状。这项针对亨廷顿疾病模型猪基因治疗的方式也为治疗其他神经退行性疾病提供了理论基础与新的思路。

2022年12月，由加州大学圣地亚哥分校Gene W. Yeo团队和约翰·霍普金斯大学段文贞团队合作在Nature Neuroscience 期刊发表的一篇题为：An RNA-targeting CRISPR–Cas13d system alleviates disease-related phenotypes in Huntington’s disease models 的研究论文中，还开发了一种靶向RNA的CRISPR基因编辑疗法治疗亨廷顿舞蹈症。

Cas13d的基因治疗原理及RNA靶向载体

来源：参考资料3

该团队在亨廷顿症小鼠模型上的研究发现，AAV递送RNA靶向的CRISPR-Cas13d疗法能够有效改善亨廷顿症小鼠模型的运动协调能力，减缓大脑纹状体退化，并降低了毒性蛋白水平。这种改善持续了至少8个月，没有发现不良反应，而且对其他RNA的脱靶效应也很小。

此外，AD也使基因编辑的潜在应用之一，在2021年，由香港科技大学科学家领衔的一支国际性研究团队开发出一种能够在大脑中广泛进行基因编辑的创新技术。在AD小鼠模型中显著降低AD的病理发生。新闻稿指出，这一先进技术有潜力成为治疗家族性阿尔茨海默病（FAD）患者的长效疗法。

在该研究中，科学家们设计了一种基于CRISPR-Cas9的基因编辑疗法。这一基因编辑疗法在注入大脑中后，能够在广泛的大脑组织中特异性地扰乱携带基因突变的淀粉样蛋白前体（APP）基因，从而显著降低动物大脑中的淀粉样蛋白水平。在FAD小鼠模型中，研究人员发现在接受一次性基因编辑疗法治疗6个月后，接受治疗的小鼠大脑中淀粉样蛋白的沉积显著低于对照组。

目前，AAV基因疗法是目前进行在耳/眼科疾病治疗的常见方法，但纵观国内外目前正在开发的AAV基因疗法，针对眼部遗传性疾病的候选药物要远远超过先天性耳聋，一方面由于野生AAV血清型对内耳细胞的感染能力不足，尤其是耳蜗支持细胞（SCs）；另一方面鉴于常见突变基因，如otoferlin (OTOF)，超出了AAV载体的装载能力等限制使得针对耳聋的临床试验寥寥无几。而基因编辑为其提供了潜在的治疗方案，虽然目前针对耳聋的基因疗法才刚刚迈入临床，但是已经在该领域积累了不错的科研成果，并且已经开始向临床转化。

早在2017年，Broad研究所的Daviad Liu和麻省总医院的Zheng-Yi Chen教授作为共同通讯作者在 Nature 发表题为：Treatment of autosomal dominant hearing loss by in vivo delivery of genome editing agents的文章，利用阳离子脂质介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术成功恢复人类遗传性耳聋小鼠模型的听力。

与此同时，李华伟与舒易来团队则在利用基因编辑技术治疗耳聋的方向上取得了诸多领先国际的进展：

2021年3月，该团队在Genome Biology期刊上发表的一项“Prevention of acquired sensorineural hearing loss in mice by in vivo Htra2 gene editing”研究中，利用AAV-Anc80L65载体递送两针对Htra2基因的CRISPR/Cas9系统（SpCas9和SaCas9）至小鼠内耳毛细胞，实现在体Htra2基因有效编辑，促进耳蜗毛细胞存活，显著改善氨基糖甙类抗生素暴露后小鼠的听觉功能。这是国际上首个基于CRISPR/Cas9基因编辑成功用于防治获得性非遗传性感音神经性耳聋的研究。

Anc80L65–SpCas9对新霉素暴露鼠毛细胞存活和听觉功能的影响

来源：参考资料4

2021年6月，该团队又在Molecular Therapy上发文，利用CRISPR/Cas9（SaCas9-KKH）系统，筛选出了特异且高效编辑的gRNA2，然后利用高效感染内耳毛细胞的AAV-PHP.eB载体将SaCas9-KKH-Myo6-g2基因编辑治疗体系递送至耳聋小鼠模型的内耳，实现了在体原位特异性敲除Myo6 C442Y突变等位基因，而不影响正常等位基因功能，并在长达5个月的观察期内，均实现了明显的听觉功能恢复。这是国际上首个利用CRISPR/Cas9技术针对Myo6基因突变导致的遗传性耳聋进行治疗，是基因编辑技术用于遗传性耳聋治疗的重要研究进展，为遗传性耳聋基因治疗临床转化提供了坚实的科学依据。

在2022年2月，李华伟与舒易来团队联合中国农业科学院（深圳）农业基因组研究所左二伟在Cell Research上发表论文，使用双AAV载体包装CRISPR/Cas9-HMEJ基因修复体系，递送至Klhl18-lowf小鼠内耳，成功纠正了Klhl18基因C>A点突变，持久改善了听觉功能。这是首个基于CRISPR/Cas9-HMEJ成功治疗隐性遗传性感音神经性聋的研究。

目前，针对眼科疾病在CGT领域临床应用较多的当属AAV基因治疗，已有大批企业进入临床阶段，相较于基因编辑已相对成熟。CRISPR在眼科疾病领域的应用整体还处在早期阶段，但大量的科研和现有临床疗效已充分展现了其在眼科疾病的潜力，包括视网膜色素变性、Leber先天性黑蒙、年龄相关性黄斑变性、增生性玻璃体视网膜病变、视网膜母细胞瘤等。

在2019年4月，由中国科学技术大学生命科学与医学部薛天团队、中国科学院神经科学研究所仇子龙团队合作，在Science Advances 杂志上发表的一项“In vivo genome editing rescues photoreceptor degeneration via a Cas9/RecA-mediated homology-directed repair pathway ”研究中，就结合视觉神经生物医学与CRISPR/Cas9基因编辑技术，首次通过同源重组修复方法（HDR）在小鼠视网膜非分裂感光细胞中实现精准基因修复，使视网膜色素变性小鼠重获部分视觉功能。

迄今为止，也有部分企业在眼科基因编辑疗法领域有深入布局，如Intellia Therapeutics/Sparing Vision，国内本导基因、辉大基因等。

BD111注射液是本导基因在研的一款治疗单纯疱疹病毒型角膜炎(HSK)体内基因编辑疗法，在今年2月4日，其IND获CDE受理。该药物利用本导基因原创性递送技术VLP转导CRISPR基因编辑工具直接靶向切割单纯疱疹病毒（HSV-1）的基因组，达到清除HSV-1病毒基因组的目的，从而实现对疱疹病毒型角膜炎的治疗。BD111具有以下特点：递送Cas9 mRNA，基因编辑酶在体内停留时间短，可以有效降低免疫反应和基因编辑脱靶风险；仅需切割病毒基因组，不需要改变任何人的基因，临床前和IIT临床研究中均未检测到对动物或人体基因组的脱靶效应。此外，据官网显示，该公司另一款基因编辑治疗湿性老年性黄斑变性（wetAMD）的候选产品BD311，已完成1例IIT人体临床。

HG-203是辉大基因在研的一款眼科基因编辑产品，旨在通过RNA编辑手段敲低VEGFA基因表达，用于治疗老年湿性黄斑病变。

此外，2021年10月，Sparing Vision还与Intellia Therapeutics达成了战略合作，利用CRISPR-Cas9技术开发基于基因组编辑的新型眼病治疗方法，目前已建立了三条相关研发管线，但均还处于早期研究阶段。

研发管线

来源：Sparing Vision官网

迄今为止，已有两款血友病AAV基因疗法获批上市，包括BioMarin的Roctavian以及uniQure/CSL Behring的EtranaDez，分别用于治疗血友病A和血友病B，但其持久性一直是人们备受争议的话题，此外，对于血友病A来说，由于其突变基因非常大，超过AAV包装上线，还存在大小限制。

CRISPR基因编辑为血友病治疗提供了一种新兴的策略，该治疗方法在2016年被首次报道，近几年相关研究逐渐增多，显示出不俗的治疗潜力。

2019年11月，由姜儒鸿领导的团队在Scientific Reports上发表了的一项研究中，开发了一种利用两种rAAV载体的基因组编辑疗法，分别编码SaCas9-gRNA和密码子优化的人B结构域缺失的人FVIII(BDD-F8)，利用CRISPR/Cas9基因组靶向/切割能力，结合非同源末端连接(NHEJ) DNA修复，以位点特异性方式在肝脏特异性白蛋白(Alb)位点整合人B结构域缺失(BDD)-F8，从而在肝脏中产生FVIII。这种治疗改善了A型血友病小鼠的疾病表型，在长达7个月的时间里促进了肝脏中FVIII蛋白和活性水平的升高，而没有可检测的肝毒性或脱靶效应。

在2022年12月，香港中文大学冯波等人在Nature Communications发表的一项“Low-dose AAV-CRISPR-mediated liver-specific knock-in restored hemostasis in neonatal hemophilia B mice with subtle antibody response”研究中，报道了低剂量AAV递送CRISPR用于治疗血友病B的成功案例，为这一疾病提供了新的基因治疗策略。

研究团队在mAlb基因的3'UTR区域的新靶点进行了AAV-CRISPR介导的非同源末端连接（NHEJ）基因敲入，这种方式使得基因敲入效率更高，提供了更大的灵活性。单剂量的AAV成功在成年和新生血友病B型小鼠中实现了有效的人源F9基因敲入和整合表达，产生了凝血因子Ⅸ，小鼠也在48周观察期间内稳定恢复凝血功能。

与此同时，Intellia和Regeneron公司合作开发治疗血友病A/B的两款相关候选产品也正在临床前开发中。另外，该公司两款针对遗传性罕见病主导产品NTLA-2001和NTLA-2002已进入临床，分别用于治疗甲状腺素运载蛋白(ATTR)淀粉样变性和遗传性血管性水肿。

除了以上罕见疾病外，CRISPR基因编辑在杜氏肌营养不良症（DMD）、脊髓性肌肉萎缩症（SMA）、囊性纤维化（CF）等罕见病以及T细胞的免疫缺陷疾病领域同样有着巨大的临床应用潜力，未来还需要更多的临床数据去验证。

与其他基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统具有周期短、细胞毒性低、价格低廉、传递简单等优势。

作为一项突破性的技术，CRISPR为临床基因治疗开辟了新的途径，但目前CRISPR编辑在生物学领域还处在一个相对较新的发展阶段，其应用于大部分疾病治疗的可行性还只是停留在概念验证上，而这些基础学术以及一些早期研究为基因编辑技术在未来医学中的临床转化奠定了基础。

未来随着CRISPR基因编辑技术的不断调整和改进，必将进一步扩大其疾病应用范围，预期越来越多的疾病可以被它攻克。

参考资料：

1.Cas13d knockdown of lung protease Ctsl prevents and treats SARS-CoV-2 infection DOI: 10.1038/s41589-022-01094-4

2.Cas9-mediated replacement of expanded CAG repeats in a pig model of Huntington's disease DOI: 10.1038/s41551-023-01007-3

3.An RNA-targeting CRISPR-Cas13d system alleviates disease-related phenotypes in Huntington's disease models  DOI: 10.1038/s41593-022-01207-1

4.Prevention of acquired sensorineural hearing loss in mice by in vivo Htra2 gene editing DOI: 10.1186/s13059-021-02311-4

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